Zusammenfassung

Der folgende Artikel gibt eine grundlegende Einführung über die Notwendigkeit, die Größe von DNA in einer räumlich begrenzten Zelle zu managen, was anhand eines Größenvergleichs der DNA- und der Zellgröße des Bakteriums Escherichia coli demonstriert wird. Danach wird ein simples Modell beschrieben, welches das Prinzip der DNA-Verpackung veranschaulicht, und welches wortwörtlich mit Stöcken und Fäden zuhause ausprobiert werden kann. Da DNA-Verpackung weitaus komplizierter ist und in der Zelle durch strukturelle Proteine und Enzyme vorangetrieben wird, werden zwei hierfür wichtige Enzyme, die bakterielle DNA-Topoisomerase I sowie die DNA-Gyrase, vorgestellt. Deren Aktivität lässt sich mit einer lang erprobten Labortechnik namens Gelelektrophorese gut untersuchen. Solche Untersuchungen werden dazu genutzt, um neue DNA-Gyrase-Hemmer zu entdecken, die als Antibiotika gegen mikrobielle Infektionen eingesetzt werden können.

Abschnitt 1 – DNA wird genutzt, um enorme Mengen an biologischer Information zu speichern

Sämtliche Information über den Aufbau und die Vorgänge in einer lebenden Zelle, wie z.B. für die Synthese von Proteinen oder genetische Schaltpläne, mit denen eine Zelle auf sich veränderte Umweltbedingungen reagieren kann, sind physikalisch auf DNA-Molekülen gespeichert. Einfach gesagt ist jeder biologische Aspekt eines Organismus in seiner DNA codiert, was ziemlich viel Information ist. Wie wir im folgenden Abschnitt sehen werden, übertrifft die absolute Größe nicht-komprimierter DNA die Größe der Zelle, die die DNA umgibt, was der Grund ist, weshalb DNA zusammengepackt und kondensiert werden muss, um in eine Zelle zu passen.

Abschnitt 2 – Warum eine kompakte DNA-Struktur essentiell ist

Um auf einen Größenvergleich zwischen einem DNA-Molekül und einer Zelle einzugehen, ist eine grundlegende Kenntnis über die Einheiten und Begriffe hilfreich, die im Zusammenhang mit der Größe eines DNA-Moleküls verwendet werden. DNA besteht aus zwei langen Molekülketten, die miteinander interagieren und eine sogenannte DNA-Doppelhelix bilden, eine der bekanntesten Illustrationen für DNA (Abbildung 1). Eine Molekülkette, auch als DNA-Einzelstrang bezeichnet, besteht aus einer Abfolge von chemischen Basen entlang eines Zucker-Phosphat-Rückgrats. Jede Base eines DNA-Strangs paart mit einer Base des anderen Strangs der DNA-Helix, weshalb die Länge eines DNA-Moleküls häufig in Basenpaaren (bp) angegeben wird 1.

A simplified scheme showing the structure of DNA
Abbildung 1: Eine vereinfachte Darstellung für die Struktur von DNA. DNA-Helices bestehen aus zwei antiparallel-verlaufenden Molekülketten, die als DNA-Einzelstränge bezeichnet werden. Die Basen Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) oder Guanin (G) sind kovalent mit einem Zucker-Phosphat-Rückgrat verbunden, und die Sequenz der Basenabfolge repräsentiert genetische Information, die von der Zelle gelesen und interpretiert wird, um bestimmte Aufgaben in der Zelle durchzuführen. DNA-Einzelstränge interagieren miteinander durch die Bildung von Basenpaaren und Wasserstoffbrückenbindungen (H-Brücken, vertikale Linien zwischen den Basen A, T, C und G). Durch die Anordnung und Interaktion der DNA-Einzelstränge bildet sich eine natürliche helikale DNA-Doppelhelix.

Die chromosomale DNA eines Bakteriums besteht aus den größten DNA-Molekülen einer Zelle und beinhaltet den Großteil der lebensnotwendigen genetischen Information. In den meisten Fällen ist die chromosomale bakterielle DNA ein einziges langes DNA-Molekül, dessen Enden miteinander verbunden sind und so eine Ringstruktur bildet 2.

Abschnitt 3 – Escherichia coli´s DNA- und Zellgröße

. Escherichia coli K12 ist ein gebräuchlicher Laborstamm, dessen Chromosom eine Größe von 4,6 Mega-Basenpaaren (Mbp) hat, was 4,6 Millionen bp DNA entspricht 3Da die physikalische Länge eines Basenpaars ca. 0,34 Nanometer entspricht 4kann die Länge der chromosomalen DNA von E. coli berechnet werden, nämlich mit 0,34 nm x 4.600.000 bp = 1.564.000 nm. Dies entspricht ungefähr 1,5 mm, also einer Länge, die mit dem menschlichen Auge sichtbar ist (Abbildung 2). Da es sich bei dem Chromosom von E. coli um eine Ringstruktur handelt, ist der Kreisdurchmesser, der mit einem 1,5 mm Faden gebildet werden kann, eine bessere Annäherung für die DNA-Größe. Mit 1,5 mm Kreisumfang hätte ein solche DNA-Ringstruktur einen Durchmesser von ca. 0,5 mm, was ebenfalls noch mit bloßem Auge erkennbar wäre. 

length of the Escherichia coli genome
Abbildung 2: Vergleich der Größe der DNA des Bakteriums Escherichia coli mit seiner Zellgröße. Die DNA von E. coli besteht aus 4,6 Millionen Basenpaaren. Ein Basenpaar hat eine Länge von 0,34 Nanometern (nm), wodurch sich eine Gesamtlänge für die DNA von E. coli von 4.600.000 x 0,34 = 1.564.000 nm ergibt, was 1.564 Mikrometer (µm) oder 1,5 Millimeter (mm) entspricht. Diese 1,5 mm lange DNA ist in eine Struktur komprimiert, die als Nucleoid bezeichnet wird. In der Realität ist das E. coli Genom kein 1,5 mm linearer Strang, sondern ein zirkuläres Molekül, welches rein mathematisch berechnet einen Kreisdurchmesser von ca. 0,5 mm (500 µm) hätte und damit ohne Komprimierung immer noch 100-200-mal größer wäre als eine E. coli Zelle.

. E. coli Zellen sind annähernd zylindrisch mit einer Länge von 0,002 – 0,004 mm und einem Durchmesser von 0,001 mm 5–7. Sie haben also eine Größe, die nicht mit dem bloßen Auge sichtbar ist. Die DNA muss also in eine viel kleinere Form gepackt sein, die von Wissenschaftlern als Nucleoid bezeichnet wird 8 (Abbildung 2).

Abschnitt 4 – Ein einfaches Model für die Verdichtung von DNA zu einer kompakteren Struktur

Während der Kondensation von DNA verdrillen sich die DNA-Doppelstränge mehrfach miteinander und bilden sogenannte mehrfach-verdrillte Super-Schlaufen (engl.: super coils), was der verpackten oder auch kondensierten DNA-Struktur in einer Zelle entspricht. In dieser kondensierten Form ist die DNA-Größe sehr viel kompakter, vergleichbar mit einem 2-Meter Zollstock, der zusammengefaltet in eine Hosentasche passt.

Ein simples Modell von DNA-Komprimierung kann man mit etwas Bastelei zuhause nachmachen, es braucht dazu zwei Fäden und zwei Stöcke (Abbildung 3). Die zwei Fäden repräsentieren zwei parallele DNA-Stränge, die in der Realität als Doppelhelix vorliegen würden. Wenn jedes Faden-Ende an jeweils einen Stock fixiert ist, sodass beide Fäden parallel zueinander verlaufen, und man dann die Fäden mit Hilfe der Stöcke spannt und verdreht, verdrillt sich die "DNA". Die auf den Fäden liegende Spannung wird abgebaut, sobald man die Stöcke näher zueinander bringt, währenddessen die verdrillten Fäden Schlaufen bilden.

A simple model of DNA packaging
Abbildung 3: Ein einfaches Modell zur Größen-Komprimierung der DNA-Struktur. Die lineare DNA besteht aus zwei DNA-Einzelsträngen, die durch sogenannte Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen den Basen der Einzelstränge miteinander verbunden sind (vertikale Linien zwischen den horizontalen Linien). Werden in diesem Modell beide Enden der parallel verlaufenden Stränge fixiert und wird ein Ende um seine horizontale Achse gedreht, verdrillt sich die DNA. Durch diese Drehung entsteht eine negative Spannung zwischen den fixierten Enden, die abgebaut wird, wenn sich beide Enden einander annähern. Die Spannung auf den verdrillten Strängen wird dabei vermindert, indem sich Schlaufen-Strukturen (engl.: super coils) ausbilden. Die absolute Länge der DNA bleibt dabei gleich, aber die DNA wird dadurch kompakter und beansprucht somit weniger Platz.

Wie alles in der Biologie ist die Verpackung und Entpackung von DNA ein ziemlich komplizierter Prozess, an dem mehrere Enzyme und strukturelle Proteine beteiligt sind, um die Struktur der DNA zu verändern und zu stabilisieren. Enzyme, die aktiv DNA verpacken -und entpacken gehören zu der sogenannten Topoisomerase-Proteinfamilie (ein gutes Review hierzu gibt es z.B. von Champoux 9).

Im Prinzip kann man die DNA einer Zelle mit einem Buch vergleichen, welches die Information über den Aufbau und sämtliche Abläufe in einer Zelle enthält. Eine bestimmte Seite des Buches wird aufgeschlagen (entpackt), um ein Transkript (eine Kopie) einer bestimmten Passage anzufertigen, wonach diese Seite anschließend wieder zugeschlagen (verpackt) wird. Das Transkript wird dann als Anleitung für die Durchführung bestimmter Aufgaben in der Zelle verwendet. DNA-Verpackung und Entpackung sind also essentiell für eine lebende Zelle, und wenn die Enzyme, die an diesen Prozessen beteiligt sind, in ihrer Funktion gehindert werden, ist dies für ein Bakterium meist tödlich. Daher werden in der Medizin z.B. Antibiotika genutzt, die Bakterien-spezifische Topoisomerasen wie die DNA Gyrase hemmen 10.

Abschnitt 5 – Durch Agarosegel-Elektrophorese kann die Aktivität von Topoisomerasen sichtbar gemacht werden

Das Verpacken und Entpacken von DNA durch die bakterielle DNA Gyrase und die Topoisomerase I können heutzutage sehr einfach in einem Labor untersucht werden. Vorher sollten wir jedoch kurz darauf eingehen, inwiefern diese Enzyme die DNA-Struktur verändern. In einer vereinfachten Darstellung betrachtet ändert die DNA Gyrase die Anzahl an Überschneidungen und damit die Anzahl von Schlaufen von miteinander verdrillten DNA-Strängen, und je mehr Schlaufen, desto kompakter ist die DNA. Dazu hält die DNA-Gyrase zwei DNA-Stränge fest und fixiert diese. Sie schneidet dann einen Strang, führt den nicht geschnittenen Strang durch die entstandene Schnittöffnung und verbindet dann den zuvor geschnittenen Strang wieder 10Die DNA Topoisomerase I relaxiert aktiv verdrillte DNA, indem sie Stränge schneidet und so eine Entwindung der DNA ermöglicht, bevor die Topoisomerase die getrennten Stränge wieder miteinander verbindet 9 (Abbildung 4).

Bisher wurde die DNA-Größe und die Verpackung von DNA anhand des Beispiels von genomischer DNA diskutiert, allerdings ist für die Analytik von DNA die Verwendung kleinerer DNA-Moleküle anstatt chromosomaler DNA sinnvoll. Hierbei sind Plasmide eine gute Wahl. Sie sind ebenso wie die meisten bakteriellen Chromosomen zirkulär und existieren neben dem bakteriellen Chromosom ebenfalls in der Zelle. Allerdings haben sie oft nur einen Bruchteil der Größe eines Chromosoms und liegen in einer höheren Kopienzahl als einer Kopie pro Zelle vor. Da sie einfach von Bakterien zu isolieren und von der genomischen DNA trennbar sind, kann man Plasmide leicht in großer Menge präparieren. Kleine Plasmide sind in der Handhabung auch sehr viel robuster als größere DNA-Moleküle, weshalb sie ein gutes Testmaterial darstellen, um die Aktivität der DNA Gyrase und der DNA Topoisomerase I zu untersuchen (Abbildung 4).

A method to investigate DNA topoisomerase activity
Abbildung 4: Eine einfache Methode zur Untersuchung der Aktivität von DNA-Topoisomerasen. Zirkuläre entspannte (relaxierte) DNA kann durch die DNA Gyrase zu Schlaufen verdrillt werden (eng.: super coils). Die DNA Topoisomerase I relaxiert hingegen super coiled DNA. Das Resultat der Aktivität beider Enzyme kann durch eine Agarose-Gelelektrophorese der jeweils enzymatisch unterschiedlich behandelten DNA untersucht werden. Obwohl beide Moleküle dieselbe absolute Größe haben, ist super coiled DNA wesentlich kompakter und kann in einem elektrischen Feld in einer festgelegten Zeitspanne schneller durch das Siebgeflecht eines Agarosegels in einem elektrischen Feld wandern als relaxierte DNA.

Die Analyse, wie viel Raum DNA-Moleküle in Abhängigkeit von ihrer Struktur beanspruchen, also wie kompakt eine DNA ist, ist recht einfach. DNA-Proben werden dazu mit Hilfe eines Agarose-Gels nach ihrer räumlichen Größe (also nicht nur nach ihrer absoluten Größe!) getrennt.

Ein Agarosegel ist ein Polymer, welches ein dreidimensionales Netz oder Geflecht bildet. Die Größe der Poren in dem Geflecht wird von der Konzentration der Agarose bestimmt, mit der man ein Agarosegel vorbereitet. Je dichter das Geflecht, desto kleiner die Poren, und desto mehr Zeit benötigen DNA-Moleküle, sich durch ein Agarosegel zu bewegen. Da die DNA-Moleküle flexibel sind, schlängeln sie sich Stück für Stück durch die Poren. Je kompakter die DNA-Moleküle sind, desto schneller können sie sich durch das Geflecht bewegen. Hierdurch kann man kompakte von weniger kompakter DNA leicht unterscheiden, da sie in einem bestimmten Zeitfenster unterschiedliche Strecken durch das Gel zurücklegen. Hierbei können die DNA-Moleküle durchaus dieselbe absolute Größe haben (dieselbe Anzahl an bp), aber aufgrund ihrer unterschiedlichen Struktur unterschiedliche Strecken zurücklegen. Die Bewegung der DNA durch das Agarosegel wird durch ein elektrisches Feld erreicht, denn DNA liegt in Abhängigkeit von dem pH-Wert meist als negativ geladenes Molekül vor, welches in einem elektrischen Feld vom negativen elektrischen Pol (Kathode) zum positiven elektrischen Pol (Anode) gezogen wird. Das Gel befindet sich hierfür in einer elektrisch leitenden Salzlösung, wodurch sich elektrisch geladene Teilchen in der Lösung zu den elektrischen Polen bewegen können, und da die DNA in Vertiefungen des Gels geladen wurde, bevor das Feld aufgebaut wird, wird die DNA dazu gezwungen, sich durch das Gel in Richtung Anode zu bewegen (Abbildung 4).

Diese Gelelektrophorese gestützte Analyse der Aktivität von DNA Topoisomerasen kann leicht für die Suche nach neuen DNA Gyrase-Hemmern eingesetzt werden, welche sich als neue einsetzbare Antibiotika erweisen könnten. Obwohl es schon DNA Gyrase-hemmende Antibiotika gibt, ist der Gebrauch von Antibiotika häufig mit der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen begleitet 11, weshalb es vernünftig ist, alternative Antibiotika zu suchen und zu erforschen.

Zum Beispiel wurde die hier geschilderte Methode zur Untersuchung der Topoisomerase-Aktivität genutzt, um den Einfluss des Naturstoffes Allicin aus Knoblauch auf die Aktivität der bakteriellen DNA-Gyrase zu untersuchen 12. Der Artikel „Allicin aus Knoblauch inhibiert das essentielle bakterielle Enzym DNA Gyrase, ein häufiges Ziel medizinischer Antibiotika“auf unserer GENAWIF-Website wäre also ein idealer Artikel, um an das hier Gelesene anzuknüpfen!

Jan Borlinghaus, 13.09.2022

Referenzen

  1. Alberts, B.; Johnson, A.; Lewi, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. The Structure and Function of DNA. In Molecular Biology of the Cell.; Garland Science: New York, 2022.
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  3. Blattner, F. R.; Plunkett, G.; Bloch, C. A.; Perna, N. T.; Burland, V.; Riley, M.; Collado-Vides, J.; Glasner, J. D.; Rode, C. K.; Mayhew, G. F.; Gregor, J.; Davis, N. W.; Kirkpatrick, H. A.; Goeden, M. A.; Rose, D. J.; Mau, B.; Shao, Y. The Complete Genome Sequence of Escherichia Coli K-12. Science 1997, 277 (5331), 1453. https://doi.org/10.1126/science.277.5331.1453.
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Auf die Größe kommt es an – die Notwendigkeit der Umstrukturierung von DNA

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